免疫分析儀問世已近40年，其技術(shù)原理發(fā)展至今已經(jīng)十分成熟了，尤其在21-22新冠浪潮，已有多家企業(yè)選擇熒光免疫分析路線。

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熒光免疫分析儀，由于一直采用的是免疫層析原理，所以也被經(jīng)常叫為熒光免疫層析分析儀，它的原理主要基于抗原-抗體特異性免疫反應(yīng)以及熒光標記技術(shù)。它利用抗原與抗體之間的高度特異性結(jié)合來檢測和定量目標分子。當待測物與熒光標記抗體結(jié)合后，通過光源照射，熒光標記物會受激發(fā)而發(fā)射熒光。這些熒光信號隨后被采集并用于定量分析待測物的濃度。

原理詳情

免疫熒光技術(shù)的原理是在硝酸纖維素膜的測試區(qū)（T）包被 BSA 與抗原的偶聯(lián)物，標記墊上含有預(yù)先包被的熒光標記抗體。

檢測時，首先用處理試劑將樣本中的抗原與標記墊上的熒光標記抗體發(fā)生結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，復(fù)合物在層析作用下沿著硝酸纖維素膜向前擴散至包被有另一種單克隆抗體的檢測區(qū)，從而形成雙抗體夾心復(fù)合物，而游離的熒光抗體則附著在質(zhì)控區(qū)。

當檢測卡插入熒光免疫分析儀后，光源照射到檢測卡上，通過模塊控制LED的發(fā)光強度以符合測量的強度要求，分析儀自動掃描檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光強度，傳感器輸出信號經(jīng)放大和濾波處理后，進入轉(zhuǎn)換芯片轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號交給處理器進行處理，通過兩種熒光強度的比值計算待測樣本中的抗原含量。

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特點

免疫熒光分析技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、耗材保存簡單、操作簡便等特點，在床旁即時檢測（POCT）領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，比如檢測病毒、激素、毒品、C- 反應(yīng)蛋白、糖化血紅蛋白、甲胎蛋白、降鈣素原等。

光路檢測及組成

作為免疫熒光分析儀的核心，在光學暗箱結(jié)構(gòu)中，一般由光源、激發(fā)光路、采集光路、光電傳感器、放大系統(tǒng)等組成。

光路有共聚焦光路和非共聚焦光路

共聚焦光路

光源產(chǎn)生與熒光標記物的吸收波長相近的單色光，單色光通過激發(fā)光路，照射在試劑條特定的掃描點上。掃描點附近的熒光物質(zhì)受激發(fā)發(fā)射熒光，采集光路（也叫接受光路）將熒光收集并聚焦到光電探測器的有效接收靶面內(nèi)。采集光路除了透鏡實現(xiàn)聚焦功能外，還通過濾光片來濾除非特定波段光的干擾。

非共聚焦光路

非共聚焦光路也叫V型光路，成本相對較低，通過兩個相同的光源分別與試劑條水平面成 45°和 135°夾角，對稱的激發(fā)光源經(jīng)過透鏡和濾光片等光學器件后，聚焦于試劑條平面形成光斑。激發(fā)出的熒光則沿著垂直于試劑條的光路通過濾光片、透鏡等光學器件到達光闌，并被光電探測器采集。光電探測器接受光信號后，將熒光強度轉(zhuǎn)換為微弱電信號。為了能夠有效的測量微弱電信號的值，系統(tǒng)中的信號放大電路對電信號進行放大。之后模數(shù)轉(zhuǎn)換器將電信號結(jié)果轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號并送給送到微處理器進行計算和定量分析。

濾光片選擇

激發(fā)濾光片：位于光源和樣品之間，用于選擇性地傳遞激發(fā)波長的光線，濾除其他非激發(fā)波長的光線，激發(fā)光路一般選用中心波長低于600nm的濾光片。在熒光免疫層析中，激發(fā)光通常是紫外光或特定波長的光，激發(fā)濾光片確保只有這些波長的光線能夠照射到樣品上，從而激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)。

發(fā)射濾光片：位于樣品和檢測器之間，用于選擇性地傳遞發(fā)射波長的熒光光線，濾除其他非熒光波長的光線。樣品受到激發(fā)光照射后發(fā)出的熒光光線會經(jīng)過發(fā)射濾光片，只有特定波長的熒光光線能夠通過，從而確保檢測器接收到的是純凈的熒光信號。根據(jù)熒光波長，采集光路一般選用中心波長在610~620nm濾光片。

二向色鏡（二色鏡），通過反射或透射特定波長的光線，實現(xiàn)激發(fā)光和發(fā)射熒光的分離。二向色鏡通常與激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片一起使用，以確保激發(fā)光和熒光信號在光路中不相互干擾。

（熒光免疫BP600窄帶濾光片）

濾光片特性要求

高截止陡度：確保濾光片在截止波長處具有陡峭的截止特性，以減少光譜重疊和干擾。

高透過率：在所需波長范圍內(nèi)具有高的透過率，以提高信號的強度和靈敏度。

高定位精度：確保濾光片在光學系統(tǒng)中的準確位置，以保證光譜的準確性和穩(wěn)定性。

高截止深度：通常要求濾光片截止深度在OD5（光密度）以上，以有效阻擋不需要的光線。

優(yōu)良的環(huán)境穩(wěn)定性：濾光片應(yīng)能在各種環(huán)境條件下保持穩(wěn)定的性能，如溫度、濕度和光照等。

在熒光免疫層析分析儀中，濾光片通常被組合使用，以形成完整的熒光檢測系統(tǒng)。例如，在檢測過程中，激發(fā)濾光片首先選擇性地傳遞激發(fā)光至樣品，樣品受到激發(fā)后發(fā)出熒光，然后熒光信號經(jīng)過發(fā)射濾光片濾除其他非熒光波長的光線，最后純凈的熒光信號被檢測器接收并進行處理分析。同時，二向色鏡在光路中起到關(guān)鍵作用，確保激發(fā)光和熒光信號的有效分離和傳遞。

綜上所述，熒光免疫層析分析儀中的濾光片是確保分析過程準確性和靈敏性的重要組成部分。通過選擇合適的濾光片類型和參數(shù)，可以優(yōu)化熒光檢測系統(tǒng)的性能并提高檢測結(jié)果的可靠性。